2）标记好加标本和对照的PCR管（阳性对照，阴性对照和试剂对照）。
　　A：阳性对照：无感染性的对照RNA。
　　B：细胞对照：使用未接种病毒的细胞悬液，最好使用与扩增病毒所用的细胞类型与代数相同的细胞。每一次实验设2个细胞对照。
　　C：试剂对照：用去离子水代替标本。
　　（3）RT-PCR扩增
　　1）在冰面上融化病毒标本和各种PCR试剂；
　　2）配下列试剂主溶液：
　　10×PCR Buffer···································································5.0μl
　　dNTPs（2.5mM each）·······················································2.0μl
　　上游引物（0.1μg/μl）·························································1.0μl
　　下游引物（0.1μg/μl）·························································1.0μl
　　RNA酶抑制剂（RNasin，40U/μl）······································0.5μl
　　Taq DNA聚合酶（5U/μl）·················································0.5μl
　　AMV逆转录酶（10U/μl）··················································1.0μl
　　模板RNA··········································································3.0μl
　　RNase Free dH₂O···························································36.0μl
　　50.0μl
　　3）在PCR仪上进行RT-PCR反应，反应步骤如下：
　　42℃························45min
　　95℃························3min
　　95℃························20s
　　45℃························25s　　×32个循环
　　72℃························30s
　　72℃························10min
　　4℃························Soak
　　3．电泳分析
　　1）将已经聚合的3%的琼脂糖凝胶放在电泳装置上；
　　2）在帕拉膜（Parafilm）上加上6 × 电泳载样缓冲液（每个反应需1μl）。再加上5μl的PCR反应产物与之混合；
　　3）将电泳缓冲液倒在电泳装置中，用吸尖将样品与载样缓冲液的混合溶液加到孔中；
　　4）盖上盖子，接通电源，以10V/cm电压（恒定电压）电泳，大约35～40min，直到溴酚蓝跑到凝胶的底部的时候，停止电泳；
　　5）将胶取出，并注意保持凝胶的方向；
　　6）在1μg/ml的溴化乙锭溶液中染色15min，--注意：溴化乙锭溶液是有毒、致畸、并且致肿瘤的物质，操作时要加小心，并戴双层手套。如果储存在避光的容器中，溴化乙锭溶液可以重复使用；
　　7）在蒸馏水中涮一下凝胶；
　　8）在紫外透射仪下观察PCR产物电泳结果，并照相作记录。
　　4．结果解释
　　通过比较标本的PCR产物与阳性对照的PCR产物在凝胶上的位置以及大小来解释结果。
　　RT-PCR实验结果解释表

待检标本RT-PCR结果	鉴定结果
所有引物（－）	非肠道病毒（NEV）
EV（＋），EV71（－），CA16（－）	非EV71、CA16的其它肠道病毒
EV（＋），EV71（＋），CA16（－）	EV71
EV（＋），EV71（－），CA16（＋）	CA16

　　五、生物安全
　　根据2006年1月11日卫生部制订的《人间传染的病原微生物名录》，柯萨奇病毒、埃可病毒、肠道病毒 71型和目前分类未定的其它肠道病毒均属于危害程度第三类的病原微生物。因此在保证安全的前提下，对临床和现场的未知样本检测操作可在生物安全II级或以上防护级别的实验室进行，涉及病毒分离培养的操作，应加强个体防护和环境保护。
　　操作粪便、脑脊液和血液等临床标本时要特别注意生物安全，要在II级生物安全柜中进行标本处理、病毒分离和病毒鉴定，无脊灰疫苗免疫史的人员要进行脊灰疫苗免疫。
　　灭活后的血清抗体检测与PCR检测可在生物安全I级实验室进行。
　　所有操作应遵守国家相关法律法规。

　　附件一

　　组　长：
　　孟　蕾　省疾病预防控制中心　主任医师　 13919004245
　　副组长：
　　金　颖　省卫生厅卫生监督所　副 所 长　 13893136639
　　雷晓燕　省人民医院（儿科）　主任医师　 3912733
　　陈　红　兰大一院 （传染科） 主任医师　 13109324136
　　组　员
　　沈玉鹏　 省中医院　　　　　　儿　科　主任医师　 13993187407
　　石宗珂　 省中医院　　　　　　儿　科　主任医师　 13893437441
　　苏怡凡　 甘肃省人民医院　　　儿　科　主任医师　 13919775197
　　林丽星　 兰州大学第一医院　　儿　科　主任医师　 13038735596
　　董湘玉　 兰州大学第二医院　　儿　科　主任医师　 13609370003
　　刘　华　 甘肃省人民医院　　　呼吸科　主任医师　 13099189673
　　石永生　 省妇幼保健医院　　　儿内科　主任医师　 13993194137
　　牛晨霞　 兰州市肺科医院　　　呼吸科　主任医师　 13919168609
　　王建云　 兰州市肺科医院　　　传染科　主治医师　 13919344388
　　于德山　 省疾病预防控制中心　应急办　主任技师　 13893629857
　　刘建地　 省疾病预防控制中心　急传科　副主任医师 13919293301

　　附件二


　　组　长：
　　雷晓燕 省人民医院　儿　科　 主任医师　 3912733
　　副组长：
　　陈　红 兰大一院　　传染科　 主任医师　 13109324136
　　组　员
　　沈玉鹏　 省中医院　　　　　儿　科　 主任医师　 13993187407
　　石宗珂　 省中医院　　　　　儿　科　 主任医师　 13893437441
　　原　睿　 省中医院　　　　　儿　科　 副主任医师 13893261330
　　苏怡凡　 甘肃省人民医院　　儿　科　 主任医师　 13919775197
　　熊海金　 甘肃省人民医院　　儿　科　 主任医师　 13919780510
　　林丽星　 兰州大学第一医院　儿　科　 主任医师　 13038735596
　　董湘玉　 兰州大学第二医院　儿　科　 主任医师　 13609370003
　　韩玉秀　 省妇幼保健院　　　儿　科　 主任医师　 2321270
　　袁　宏　兰州大学第一医院　 传染科　副主任医师　13119307641
　　李宇宁　兰州大学第一医院　 儿　科　 主任医师　 13993127126
　　朱保权　兰州大学第二医院　 儿　科　 主任医师　 13893660155
　　刘　华　省人民医院　　　　 呼吸科　 主任医师　 13099189673
　　石永生　省妇幼保健医院　　 儿内科　 主任医师　 13993194137
　　牛晨霞　兰州市肺科医院　　 呼吸科　 主任医师　 13919168609
　　王建云　兰州市肺科医院　　 传染科　 主治医师　 13919344388


　　组　长：
　　金　颖　 省卫生厅卫生监督所　副所长　　13893136639
　　副组长：
　　张福荣　 省卫生厅卫生监督所　科　长　　13359426259
　　组　员：
　　李　玲　 省卫生厅卫生监督所　科　长　　13893222833
　　陈　荣　 省卫生厅卫生监督所 主任科员　　3236390
　　史　剑　省卫生厅卫生监督所 副主任科员　13609372124
　　冉玉昭　 省卫生厅卫生监督所　科　员　　13919170303
　　尚　晶　 省卫生厅卫生监督所　科　员　　13919137742

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