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3% L-谷氨酰胺 1ml
7.5%碳酸氢钠 2ml
胎牛血清 2ml
青、链霉素（各10000U/ml） 10ml
B液：细胞营养液：（按生长液配方配制，100ml中含下列液体）
MEM 85ml
3% L-谷氨酰胺 1ml
7.5%碳酸氢钠 2ml
HEPES 1ml
胎牛血清 10ml
青、链霉素（各10000U/ml） 1ml
C液：病毒（血清）稀释液：（按维持液配方配制，100ml中含下列液体）
MEM 93ml
3% L-谷氨酰胺 1ml
7.5%碳酸氢钠 2ml
HEPES 1ml
胎牛血清 2ml
青、链霉素（各10000U/ml） 1ml
2．攻击病毒CCID50滴定和滴度梯度制备
（1）将增殖后的病毒悬液冻融3次，然后在4℃、12000rpm条件下离心10min，取上清液分装于2支冻存管中，每管1.5ml，一般每管应在一次试验中用完，有剩余者应废弃；
（2）加Eagle液10倍系列稀释为10-1至10-8病毒液，各加入细胞板内，每孔50μl，每稀释度4孔细胞；
（3）每孔加细胞悬液50μl，同时设细胞对照（50μl稀释液＋50μl细胞悬液）， 36℃培养7d，观察细胞病变；
（4）按Behrens-Kärber公式计算出分离病毒株的CCID50；
log CCID50 ＝ L-d （S -0.5 ），其中：
L ＝ 实验中使用的最低稀释度的log值；
d ＝ 稀释梯度的log值；
S ＝ 终判时阳性部分的总和（即出现CPE的细胞孔所占的比例之和）。
（5）正式试验前应先滴定攻击病毒2～3次，取其平均值，求出每0.05ml中含100 CCID50的病毒载量；
（6）按照计算好的稀释比例配制攻击病毒，求出试验所需的病毒总量（即100 CCID50/0.05ml）；
（7）取3支小试管，每只加病毒稀释液（液体配制中的C液）0.9ml；
（8）用带滤芯的吸尖（ART吸尖）吸0.1ml已经稀释好的攻击病毒液（即10 CCID50/0.05ml）到第一支小试管中，换另一支ART吸尖，轻轻并彻底地混匀，避免产生大量气溶胶，按照此方法依次稀释至1 CCID50/0.05ml和0.1 CCID50/0.05ml。
3．稀释血清
（1）发病1～3d内采取患者急性期血清，发病后2～4周采取恢复期血清，分别－20℃冻存备检。
（2）取无菌小试管若干支（每份血清使用一支）置试管架上，每管加血清处理液（上面液体配制中的A液）0.3ml，加待测血清0.1ml，盖紧塞子，震摇混匀，放4℃冰箱过夜，即为1：4稀释血清。次日56℃、30min灭活。
（3）打开独立无菌包装48孔组织培养板，纵向使用，每孔加血清稀释液（上面液体配制中的C液）0.3ml，每份血清使用一排，每排4孔。使用移液器取处理过的血清0.1ml加入第一孔（即为1：16），吹吸8～10次，吸0.1ml加入第二孔（即为1：64），依次至1：1024，血清稀释的过程中不必换吸尖。即每份血清标本进行4倍倍比稀释，即1：4、1：16、1：64、1：256、1：1024。
（4）每份血清标本的每个稀释度都要平行做两孔。
4．病毒中和抗体测定的操作步骤：
（1）取一块96孔板横向使用，每块板可以做8份（4对）待测血清，版面设计如下图所示。A1-A2孔（B1-B2、C1-C2、D1-D2、E1-E2、F1-F2、G1-G2、H1-H2）中每孔加入1：1024稀释度的待测血清0.05ml，不必换吸尖，在A3-A4孔（B3-B4、C3-C4、D3-D4、E3-E4、F3-F4、G3-G4、H3-H4）中每孔加入1：256稀释度的待测血清0.05ml，A5-A6孔（B5-B6、C5-C6、D5-D6、E5-E6、F5-F6、G5-G6、H5-H6）中每孔加入1：64稀释度的待测血清0.05ml，A7-A8孔（B7-B8、C7-C8、D7-D8、E7-E8、F7-F8、G17-G8、H7-H8）中每孔加入1：16稀释度的待测血清0.05ml，A9-A10孔（B9-B10、C9-C10、D9-D10、E9-E10、F9-F10、G9-G10、H9-H10）中每孔加入1：4稀释度的待测血清0.05ml，A11-A12孔（B11-B12、C11-C12、D11-D12、E11-E12、F11-F12、G11-G12、H11-H12）为每份待测血清对照孔，每孔中补加稀释液0.05ml；
（2）上述孔中分别加入病毒0.05ml（病毒滴度事先已经稀释为100 CCID50/0.05ml）；
（3）盖好盖子后用微量板混匀器混匀，放入36℃ CO2孵箱中孵育2h；
（4）另取一块96孔板纵向使用，做100 CCID50/0.05ml病毒滴度的核实（每次实验都必须做）。每孔先加病毒稀释液（试剂配制中的C液）0.05ml，然后从0.1 CCID50/0.05ml加起，每孔0.05ml，每个稀释度8孔，不必更换吸尖，一直加至100 CCID50/0.05ml；同时留出4孔做为细胞对照孔，每孔加入0.1ml病毒稀释液，然后放入4℃冰箱中暂存；
（5）在孵育期间，用消化液消化细胞，准备细胞悬液，细胞悬液的浓度为2×105个/ml，每块96孔板至少需要准备10ml；
（6）孵育结束后每个待测血清孔、血清对照孔（待检标本板）和病毒回滴孔和细胞对照孔（病毒回滴板）分别加入0.1ml细胞悬液，然后用微量板混匀器混匀，放入36℃ CO2孵箱中孵育培养；
（7）使用倒置显微镜每天观察CPE，并记录病毒滴定结果，以不产生细胞病变的血清最高稀释度的倒数为终点效价。当100 CCID50/0.05ml的病毒对照孔出现完全病变时，判定最终结果（约5～7d）；
（8）注意：如果病毒对照结果（病毒回滴）不在32～320 CCID50/0.05ml的范围内，实验无效，就要重复实验。
5．结果判定：
当最高稀释度血清的2孔中有1孔出现细胞病变，另一孔不出现细胞病变，该稀释度的倒数计即为该血清标本的中和抗体效价；当高稀释度2孔完全病变，相邻低稀释度2孔完全不病变，则两者平均稀释度的倒数即为该血清标本的中和抗体效价；当两个相邻稀释度血清均出现1孔细胞病变，另1孔不出现细胞病变，则两者平均稀释度的倒数即为该血清标本的中和抗体效价。
对于HFMD的双份血清中和实验结果来说，如果恢复期血清较急性期血清EV71或CA16中和抗体滴度出现4倍或4倍以上增高即可确诊；如果恢复期血清较急性期血清其它肠道病毒中和抗体滴度出现4倍或4倍以上增高可证实该肠道病毒感染，是否为病因需要其它相关实验证实；如果单份血清中和抗体滴度大于1：256也有诊断意义，血清中和抗体滴度为1：128判定为可疑阳性。
（三）逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）
1．RNA提取
可使用商业化试剂盒来提取RNA，如使用QIAGEN Viral RNA Mini Extraction Kit（CAT：52904）从临床标本或病毒分离培养物中提取病毒RNA；
（1）向一支1.5ml离心管中加入560μl的AVL缓冲液（含Carrier RNA）；
（2）再向这支离心管中加入140μl临床标本或病毒分离培养物，充分混匀至少15s；
（3）室温下（15℃～25℃）放置10min，然后瞬时离心；
（4）加入560μl纯酒精，充分混匀至少15s，瞬时离心；
（5）小心加入约630μl的混合溶液至QIAamp柱中（试剂盒附带），将QIAamp柱套在收集管上，然后8000 rpm离心5s，使液体通过滤膜；
（6）弃去收集管中的液体，重复第6步骤；
（7）弃去收集管中的液体，小心加入750μl的AW1缓冲液，8000 rpm离心5s，使液体通过滤膜；
（8）弃去收集管中的液体，小心加入750μl的AW2缓冲液，8000 rpm离心5s，使液体通过滤膜；
（9）弃去收集管中的液体，13000 rpm再次离心1min；
（10）将QIAamp柱放入一支干净的1.5ml的离心管中；
（11）向膜上加入40μl的EB缓冲液，然后室温下静置2～5min；
（12）在离心机中以8000 rpm的速度离心1min，离心下来的液体即为所需的核酸溶液。
2．RT-PCR扩增
（1）引物序列合成
1）人肠道病毒（包括EV71、CA16）核酸检测通用引物序列：
PE2（上游）：5`- TCC GGC CCC TGA ATG CGG CTA ATC C -3`
PE1（下游）：5`- ACA CGG ACA CCC AAA GTA GTC GGT CC -3`
2）EV71核酸检测引物序列：
EV71-S（上游）：5`- GCA GCC CAA AAG AAC TTC AC -3`
EV71-A（下游）：5`- ATT TCA GCA GCT TGG AGT GC -3`
3）CA16核酸检测引物序列：
Cox A16-S（上游）：5`-ATT GGT GCT CCC ACT ACA GC-3`
Cox A16-A（下游）；5`-TCA GTG TTG GCA GCT GTA GG-3`
（2）实验设计
1）在PCR记录纸（实验记录纸）上记录本次实验操作者姓名，实验日期，所鉴定标本的名称以及标本的顺序，与PCR仪排列的顺序一致。
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