机动车在南京二桥上行驶时，乘车人不准站立，不准向车外抛弃物品。货运机动车除驾驶室以外的任何部位不准载人。任何车辆不准超员、超限。经称重系统确认，南京二桥管理局执法人员有权对过桥的超限车辆进行检查，责令其改道运行或者卸载。
第二十条 禁止在南京二桥上停车、上下人员、装卸货物或者掉头、倒车、逆行和穿越中央分隔带。
禁止在行车道上检修机动车，因故障需要临时停车检修，应当驶停在紧急停车带内进行。
机动车因事故等原因不能离开行车道停车时，驾驶员应当立即开启危险报警闪光灯，并在行驶方向的后方１００米左右处设置警告标志牌夜间应当同时开启示宽灯和尾灯。驾驶员和乘车人应当迅速转移到紧急停车带内，并立即报告南京二桥监控中心。
第二十一条 因雨、雾、雪、大风、严重自然灾害、处置突发性事件、交通事故以及重大施工等原因，南京二桥不能正常通行时，公安交通管理部门可以采取临时交通管制措施，需要关闭交通的，公安交通管理部门和南京二桥管理局共同发布公告后，由南京二桥监控中心及时发布交通信息。
第二十二条 通过南京二桥水域的船舶应当满足南京二桥设计净空高度的要求，谨慎驾驶，确保安全通过。
因南京二桥养护、维修和检测，实行水上临时交通管制的，船舶应当按照港航监督部门发布的航行通告通行。
第二十三条 除执行紧急公务的人民警察和南京二桥管理局执法人员对超限车辆检查外，任何单位和个人不得在南京二桥管理范围拦截检查车辆。
第二十四条 严禁聚众堵塞南京二桥交通或者妨碍南京二桥交通、治安秩序。
第二十五条 南京二桥的交通标志、标线由南京二桥管理局按照国家和省的有关规定设置，设置的交通标志、标线必须整齐、醒目。南京二桥管理局应当保持交通安全设施的完好。
任何单位、个人不得毁损或者擅自移动、涂改、拆除交通标志、标线和交通安全设施。
第五章 经营管理
第二十六条 车辆通过南京二桥必须缴纳车辆通行费，不得拒绝缴费，强行通过；不得故意堵塞收费车道，影响收费公路畅通。
