(3)直接在塑料管上用油性记号笔写明样本的种类、采样时间、编号、姓名,同时也将标本有关信息填在禽流感人体标本送检登记表,连同塑料管用另一塑料袋密封。
(4)将装标本的密封袋放入专用运输箱内(或疫苗冷藏包),放入冰排,然后以柔软物质填充,内衬具吸水和缓冲能力的材料。同一患者两份以上的密封标本,可以放在同一个塑料袋内再次做密封。若将进行病毒分离,可将密封好的装有标本的容器直接放入液氮运输罐内运输。所有容器必须印有生物危险标识。
2.标本运送
(1)航空或铁路运送。
(2)专人专车运送:主要用于近距离样品运送。
3.标本的接收
(1)各省级中心实验室应公布标本接收联系方式,并实行24小时标本接收制;
(2)国家实验室标本接收:
需送国家流感中心实验室检测的原始标本、病毒分离物、可疑阳性标本、血清等,填写标本送检登记表,在低温保存条件下,于24小时内送至中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所流感中心进行复核。国家流感中心标本接收联系方式为:中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所,地址:北京市宣武区迎新街100号,联系人:郭元吉、王敏,联系电话:010—63534632,010—63581337,传真:010—63534632。
五、标本检测方法
1.禽H5病毒核酸检测
材料:疑似禽流感患者的咽、鼻拭子或含漱液,死亡病例的尸检肺组织、气管分泌物等。
方法:RT-PCR,用于禽H5亚型流感病毒的快速检测、测序及排除工作。
试剂:特异性H5及甲型流感病毒的引物、病毒RNA提取试剂盒、逆转录酶、Taq DNA聚合酶等试剂,建议使用德国QIAGEN的Rneasy Mini Kit(病毒核酸提取)和QIAquick Gel Extraction Kit(PCR产物纯化)产品。
2.病毒分离及鉴定
材料:疑似禽流感患者的咽、鼻拭子或含漱液,死亡病例的尸检肺组织、气管分泌物等。
方法:采用鸡胚和MDCK细胞分离方法,血凝及血凝抑制试验(HAI)具体方法详见国标《流行性感冒诊断标准及处理原则》。经特异性H5 RT-PCR病毒核酸检测阳性标本的病毒分离及鉴定工作必须在安全Ⅲ级(BSL-3级)实验室里操作。
试剂:鸡胚接种采用SPF鸡胚,MDCK细胞等。
3.疑似病例的血清学检测
材料:疑似病例的急性期和恢复期的双份血清。
方法:血凝抑制实验具体方法详见国标《流行性感冒诊断标准及处理原则》。
试剂:H5灭活病毒。
4.微量中和试验
材料:疑似病例的急性期和恢复期的双份血清。
试剂:H5活病毒,必须在生物安全Ⅲ级(BSL-3级)实验室里操作。
六、检测结果的确认
以下情况的原始标本及分离物送国家流感中心检测、复核、确认。
1.标本分离物血凝试验(HA)阳性,同时H5血凝抑制试验(HI)阴性,H5的RT-PCR检测阳性。
2.标本分离物血凝试验(HA)阳性,同时H5血凝抑制试验(HI)阳性或H5的RT-PCR检测阳性。
3.标本分离物血凝试验(HA)阳性,同时H5的RT-PCR检测阳性。
4.病人恢复期血清比急性期血清的H5抗体有4倍或以上增高。
5.标本分离物血凝试验(HA)阳性,H5血凝抑制试验阴性,并已排除了是当前流行的甲、乙型毒株的可能。
七、检测结果报告
一般情况下,实验室收到的样本立即进行实验,并于收到标本后24小时内出具RT-PCR检测报告,3~5天出具病毒分离培养结果,于分离到病毒后的3~5天出具流感病毒的血凝抑制结果,微量中和实验须3~5天完成。